Fadime Eroglu, Department of Parasitology, Faculty of Medicine, University of Aksaray, Aksaray, Turkey e-mail: eroglufadime@hotmail.com                                      

Identification of Spore-Forming Intestinal Parasites with Pentaplex Real-Time PCR

Abstract

Objective: Spore-forming intestinal parasites; Cryptosporidium spp., Cyclospora spp., Cytoisospora spp., Encephalitozoon spp., and Sarcoystis spp. are very common in immunocompromised patients, but these parasites are overlooked by healthcare proffesionals. It was aimed to develop a new pentaplex real-time PCR panel for the identification of spore-forming intestinal parasites in this study.

Methods: Primer-probes for pentaplex real-time PCR were designed using the “PrimerQuest Tool (Integrated DNA technologies, Coralville, USA) software program” and “Multiple sequence alignment use a computer software Primer Express™Software v3.0.1 Lience (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)”. The primer-probes designed in the study were spore-forming Cryptosporidium spp. (ATCC®87715™), Cyclospora spp. (ATCC®PRA-3000SD™), Cystoispora spp. (KF648871), Encephalitozoon spp. (FJ026010) and Sarcocystis spp. (ATCC®CCL-70) parasites were amplified with DNA isolates from the American Type Culture Collection (ATCC) and then these primer-probes were validated with 232 DNA samples obtained from the stools of the patient samples.

Results: It was found that Cycle Threshold (Ct) ±25.7, Standard curve (R2 ): ±0,993, and Efficiency (E): %96,1 according to the results of multiplex real-time PCR analysis. Similar results were found in pentaplex real-time PCR analysis of DNA isolates of stool samples. When the pentaplex real-time PCR results of DNA samples isolates from stool samples were compared with the positivie predictive value results of traditional methods, it was found that the pentaplex results were higher.

Conclusion: The new designed pentaplex real-time PCR panel can be used in the diagnosis of spore-forming intestinal parasites, which are very common in immunocompromised patients. Thus, the diagnosis of five different parasites can be made faster, more economically and faster with a single reaction.

Keywords: Spore-forming intestinal parasites, pentaplex real-time PCR, rapid diagnostic

Spor Oluşturan Bağırsak Parazitlerinin Pentaplex Real-Time PCR ile Tanımlanması

Öz

Amaç: Spor oluşturan bağırsak parazitleri; Cryptosporidium spp., Cyclospora spp., Cytoisospora spp., Encephalitozoon spp., ve Sarcoystis spp. bağışıklığı baskılanmış hastalarda çok yaygındır, ancak bu parazitler sağlık personeli tarafından göz ardı edilir. Bu çalışmada spor oluşturan bağırsak parazitlerinin tanımlanması için yeni bir pentaplex real-time PCR panelinin geliştirilmesi amaçlanmıştır.

Yöntemler: Pentaplex real-time PCR için primer-problar “Primer Quest Tool (Integrated DNA technologies, Coralville, USA) software programı” ve “Multiple sequence alignment use a computer software Primer Express™Software v3.0.1 Lience (ThermoFisher Scientific, Waltham, USA)” programı kullanılarak tasarlandı. Çalışmada tasarlanan primer-problar, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (ATCC)’nunda temin edilen, spor oluşturan Cryptosporidium spp. (ATCC®87715™), Cyclospora spp. (ATCC®PRA-3000SD™), Cystoispora spp. (KF648871), Encephalitozoon spp. (FJ026010), and Sarcocystis spp. (ATCC®CCL-70) parazitlerinin DNA izolatları ile amplifiye edildikten sonra hasta örneklerinden elde edilen 232 DNA örneği ile doğrulandı.

Bulgular: Pentaplex real-time PCR analizi sonuçlarına göre analizin döngü Eşiği (Ct) ±25,7, standart eğrisi (R2 ): ±0,993 ve verimliliği (E): %96,1 olarak bulundu. Dışkı örneklerinin DNA izolatlarının pentaplex real-time PCR analizinde de benzer sonuçlar bulundu. Dışkı örneklerinden izole edilen DNA örneklerinin pentaplex sonuçları ile geleneksel yöntemlerin pozitif öngörme değerinin yüksek olduğu bulundu.

Sonuç: Bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarda çok sık görülen sporlu bağırsak parazitlerinin tanısında yeni tasarlanan pentaplex real-time PCR paneli kullanılabilir. Böylece beş farklı parazitin tanısı tek bir reaksiyon ile daha hızlı, daha ekonomik ve daha hızlı konulabilir.

Anahtar kelimeler: Sporlu bağırsak parazitleri, pentapleks gerçek zamanlı PCR, hızlı teşhis.

Dicle Med J  2023; 50 (2): 194-202

Doi: 10.5798/dicletip.1313299