Ceyhan Hacıoğlu, Düzce Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, Düzce Türkiye, e-posta: ceyhanhacioglu@duzce.edu.tr                   

The effects of valproic acid on C6 glioblastoma cells viability via ferroptosis regulation

Abstract

Objective: Glioblastoma (GBM) is among the deadliest brain tumors with an invasive character and an average survival time of one year. Even after standard treatment including surgery, radiotherapy and chemotherapy, recurrences are mostly re-appeared. Ferroptosis is a newly defined form of cell death that targets different cellular molecules in an iron-dependent manner. Valproic acid (VPA) is a fatty acid that is a histone deacetylase inhibitor used in the treatment of epilepsy. Thanks to its neuroprotective and anti-tumor effects, VPA effectively suppresses tumor invasion in vitro and in vivo models. In this study, we aimed to investigate the antiproliferative effects of VPA as a ferroptosis stimulating agent in C6 cells.

Method: Firstly, we determined the cytotoxic VPA concentration by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) analysis. Then, we measured glutathione peroxidase 4 (GPx4), 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG), glutathione (GSH) and malondialdehyde (MDA) levels in C6 cells with 24-hour VPA treatment using appropriate kits by ELISA method.

Results: C6 cells were incubated with VPA concentrations of 0.1, 0.5, 1, 2, 4 and 8 mM for 24 hours. There was a statistically significant decrease in cellular viability at 1 mM VPA concentrations and above (p<0.05). According to MTT analysis, IC25, IC50 and IC 75 values were determined as 2.8 mM, 5.6 mM and 7.4 mM, respectively. There was a concentration-dependent increase in GPx4 and GSH levels in C6 cells treated with VPA. In addition, the highest decreases in GPx4 and GSH levels were detected with 64.4% and 33.5% at the 7.4 mM VPA concentration, respectively (p<0.0001). On the other hand, MDA levels, a lipid peroxidation biomarker, increased with increased antioxidant capacity in C6 cells with VPA treatment. Similarly, VPA treatment by disrupting cellular integrity increased concentration-dependently in 8-OHdG levels.

Conclusion: Our results support that VPA treatment suppresses cellular viability in a manner associated with the ferroptosis signaling pathway in rat C6 glioblastoma cells. However, the effects of VPA over a wider time range in other in vitro and in vivo glioma models have yet to be investigated. Therefore, uncertainty about how it will affect survival in clinical practice remains.

Keywords: Glioblastoma, ferroptosis, valproic acid.

Valproik asidin ferroptozregülasyonu yoluyla C6 glioblastoma hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkileri

Öz

Amaç: Glioblastoma (GBM) invaziv karakteriyle ortalama sağ kalım süresinin 1 yıl olduğu en ölümcül beyin tümörleri arasında yer alır. Cerrahi operasyon, radyoterapi ve kemoterapiyi içeren standart tedavi sonrasında bile nüksler çoğunlukla yeniden görülmektedir. Ferroptoz, demir bağımlı olarak farklı hücresel molekülleri hedef alan yeni tanımlanmış bir hücre ölümü şeklidir. Valproik asit (VPA), epilepsi tedavisinde kullanılan histondeasetilaz inhibitörü olan bir yağ asididir. VPA, nöroprotektif ve anti-tümör etkileri sayesinde in vitro ve in vivo modellerde tümör invazyonunu etkili bir şekilde baskılamaktadır. Bu çalışmada, C6 hücrelerinde VPA’nın ferroptoz uyarıcı bir ajan olarak antiproliferatif etkilerini araştırmayı amaçladık.

Yöntemler: İlk olarak, sitoksik VPA konsantrasyonunu 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) analizi belirledik. Ardında, 24 saatlik VPA uygulamasıyla C6 hücrelerindeki glutatyonperoksidaz 4 (GPx4), 8-hidroksi-2'-deoksiguanozin (8-OHdG), glutatyon (GSH) ve malondialdehit (MDA) seviyelerini ELİSA yöntemiyle uygun kitler kullanılarak ölçtük.

Bulgular: C6 hücreleri 0.1, 0.5, 1, 2, 4 ve 8 mM VPA konsantrasyonları ile 24 süreyle inkübe edildi. 1 mM ve üzerindeki VPA konsantrasyonlarında hücresel canlılıkta istatiksel olarak anlamlı düşüş olmuştur (p<0.05). MTT analizi doğrultusunda IC25, IC50 ve IC75 değerleri sırasıyla 2.8 mM, %5,6 mM ve 7.4 mM olarak belirlenmiştir. VPA uygulanan C6 hücrelerinde GPx4 ve GSH seviyelerinde konsantrasyonuna bağımlı şekilde artış olmuştur. Ek olarak GPx4 ve GSH seviyelerindeki en fazla düşüş sırasıyla %64,4 ve %33,5 ile 7.4 mM VPA konsantrasyonunda tespit edilmiştir (p<0.0001). Öte yandan, VPA uygulamasıyla C6 hücrelerinde düşen antioksidan kapasite ile birlikte lipit peroksidasyon biyobelirteci olan MDA seviyeleri artmıştır. Benzer şekilde, VPA uygulaması hücresel bütünlüğü bozarak, konsantrasyona bağlı olarak 8-OHdG seviyelerinde arttı.

Sonuç: Sonuçlarımız, sıçan C6 glioblastoma hücrelerinde, VPA uygulamasının ferroptoz sinyal yolağı ile bağlantılı bir şekilde hücresel canlılığı baskıladığını desteklemektedir. Bununla birlikte, VPA'nın daha geniş bir zaman aralığında diğer in vitro ve in vivoglioma modellerinde etkileri henüz araştırılmamıştır. Bu nedenle, klinik uygulamalarda sağ kalımı nasıl etkileyeceği konusundaki belirsizlik devam etmektedir.

Anahtar kelimeler: Glioblastoma, ferroptoz, valproik asit

Dicle Med J  2022; 49 (4): 667-674

Doi: 10.5798/dicletip.1220937