Gökçe Yıldırım Buharalıoğlu, Ege Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye, e-mail: yildirim5559@hotmail.com

Investigations on KDM6A/B Mediated Epigenetic Regulation of CTBP1 and NF2 Gene Expression in Prostate Cancer Cells

Abstract

Objective: Our aim is to investigate the modulatory role of epigenetic regulators, lysine demethylase 6A (KDM6A) and/or lysine demethylase 6B (KDM6B), on the regulation of C Terminal binding protein1 (CTBP1) and Neurofibromatosis type2 (NF2), which play a role in prostate cancer development and progression.

Methods: LNCaP cells were treated with KDM6 family selective inhibitor, GSK-J4, followed by total RNA isolation and cDNA synthesis. Change in CTBP1 and NF2 mRNA and pre-spliced mRNA levels were measured by RT-qPCR. To identify which KDM6 enzyme is responsible for regulation of CTBP1 and NF2 expression individually, changes in mRNA levels of aforementioned genes were measured by RT-qPCR in KDM6A and/or KDM6B (KDM6A/B) silenced cells via small interfering RNA (siRNA) mediated silencing.

Results: CTBP1 and NF2 mRNA levels were decreased by 45% and 49% with GSK-J4. CTBP1 and NF2 pre-spliced mRNA levels, which are surrogate marker of transcriptional rate, were also shown to be decreased by 43% and 29%, respectively with GSK-J4. Our data obtained from siRNA mediated silencing of KDM6A/B demonstrated that CTBP1 and NF2 mRNA levels were decreased by 56% and 39%, respectively by dual inhibition of KDM6A and KDM6B.

Conclusion: Our pre-spliced mRNA data strongly supported that the reductions in mRNA levels by GSK-J4 were caused by the changes in transcriptional rate. Demonstration of both KDM6A and KDM6B controlling roles in the regulation of CTBP1 and NF2 levels has contributed to elucidating a novel therapeutically targetable mechanism that modulates CTBP1 and NF2 expressions via KDM6A and KDM6B in prostate cancer.

Keywords: CTBP1, NF2, prostate cancer, epigenetic, KDM6A/B

CTBP1 ve NF2 Gen Ekspresyonlarının Prostat Kanser Hücrelerinde KDM6A/B Aracılı Epigenetik Regülasyonunun İncelenmesi

Öz

Amaç: Çalışmanın amacı, epigenetik regülatörlerden lizin demetilaz 6A (KDM6A) ve/veya lizin demetilaz 6B’nin (KDM6B) prostat kanseri oluşumu ve progresyonunda rol oynayan C Terminal bağlayıcı protein1 (CTBP1) ve Nörofibromatozis Tip2 (NF2) ekspresyonlarının regülasyonu üzerindeki modüle edici rolünün aydınlatılmasıdır.

Yöntemler: Prostat kanseri metastatik hücreleri LNCaP’lere KDM6 ailesi selektif inhibitörü GSK-J4 uygulanıp, total RNA izolasyonu ve cDNA sentezi yapılarak; CTBP1 ve NF2 mRNA düzeylerindeki değişiklikler reverse transcription-quantitative real time PCR (RT-qPCR) ile gösterilmiştir. Saptanan değişikliklerin transkripsiyonel inhibisyondan kaynaklanıp kaynaklanmadığını araştırmak üzere CTBP1 ve NF2 pre-spliced mRNA düzeylerindeki değişiklikler RT-qPCR ile ölçülmüştür. KDM6A ve/veya KDM6B’nin (KDM6A/B) small interfering RNA (siRNA) aracılı susturulduğu hücrelerde CTBP1 ve NF2 mRNA düzeylerindeki değişiklikler RT-qPCR ile gösterilerek bu genlerin KDM6 enzimlerinin hangisi tarafından regüle edildiği belirlenmiştir.

Bulgular: CTBP1 ve NF2 rölatif mRNA düzeyleri GSK-J4 ile %45 ve %49 azalmıştır. Saptanan azalmaların CTBP1 ve NF2 mRNA ekspresyonlarının GSK-J4 tarafından transkripsiyonel baskılanmasıyla ilişkili olup olmadığını belirlemek üzere yapılan RT-qPCR deneylerinde CTBP1 ve NF2 pre-spliced mRNA düzeyleri de %43, %29 azalmıştır. GSK-J4’ün KDM6 ailesine selektif bir inhibitör olması nedeniyle CTBP1 ve NF2 mRNA ekspresyonlarının hangi KDM6 enzimi tarafından kontrol edildiğini belirlemek amacıyla KDM6A ve/veya KDM6B susturulduğunda; KDM6A ve KDM6B dual inhibisyonunda CTBP1 ve NF2 mRNA düzeyleri %56, %39 azalmıştır.

Sonuç: Özetle; GSK-J4 uygulanmasıyla CTBP1 ve NF2 mRNA düzeylerinde saptadığımız azalmaların transkripsiyondaki değişiklikten kaynaklandığı pre-spliced mRNA verilerimizle güçlü bir şekilde desteklenmiştir. KDM6A ve KDM6B’nin her ikisinin de CTBP1 ve NF2 ekspresyonlarının prostat kanserindeki regülasyonunda kontrol edici rollerinin olduğunun gösterilmesi; terapötik olarak hedeflenebilecek, KDM6A ve KDM6B aracılığıyla CTBP1 ve NF2 ekspresyonlarını modüle eden yeni bir mekanizmanın aydınlatılmasına katkı sağlayabilir.

Anahtar Kelimeler: CTBP1, NF2, prostat kanseri, epigenetik, KDM6A/B

Dicle Med J  2022; 49 (1): 220-228

Doi: 10.5798/dicletip.1086401